實驗研究 | 上樣量多少對睪酮軟膏體外透皮試驗的經皮吸收數據影響

引言：

韓國檀國大學Jueng-Eun Im、Kyu-Bong Kim團隊聯合韓國食品藥品安全評估院等機構，在《Pharmaceutics》（2021年，Vol.13, IF=6.525）發表研究，通過Biox AquaFlux™ AF200和Hanson Franz擴散池系統，明確了應用量對睪酮體外皮膚吸收的影響，提出了風險評估所需的應用劑量。

摘要：

化學品的皮膚吸收是風險評估的重要因素。本研究探討了不同應用量對皮膚吸收的影響，并提出了適宜的應用劑量以實現可靠的皮膚吸收。選用cafe和睪酮作為測試化合物，采用Franz擴散池進行體外皮膚吸收試驗。將含1%cafe和0.1%睪酮的半固體（乳膏）和液體（溶液）制劑，以不同用量（5、10、25、50毫克或微升/平方厘米）分別應用于大鼠和微型豬（Micropig®）皮膚。

24小時后，采用液相色譜-串聯質譜（LC-MS/MS）或高效液相色譜（HPLC），測定皮膚表面、角質層、真皮與表皮及受體液中兩種化合物的濃度。結果顯示，在大鼠和微型豬兩種皮膚類型，以及乳膏和溶液兩種制劑中，兩種化合物的皮膚吸收率均隨應用量增加而下降。尤其在50毫克（或微升）/平方厘米用量下，兩種化合物在大鼠和微型豬皮膚中的吸收率，均顯著低于5或10毫克（或微升）/平方厘米用量組。因此，為獲得保守的皮膚吸收數據，應采用低劑量（5或10毫克/微升/平方厘米）的制劑進行應用。

體外Franz擴散池設備：

所有大鼠和微型豬（Micropig®）皮膚膜均以真皮面朝下的方式，安裝在Franz擴散池中。該設備配置Vision Microette自動進樣器、循環水浴鍋、攪拌板、攪拌控制器及自動補液功能（美國加利福尼亞州查茨沃思市漢森公司）。受體液（RF）室體積為12毫升，水浴鍋溫度設定為32.5℃，通過水循環維持受體液恒溫。受體室中分別裝入pH 7.4的磷酸鹽緩沖液（PBS）和含6%（體積分數）聚乙二醇（PEG）的PBS，分別作為睪酮測試的受體液。

皮膚膜解凍至室溫后安裝到Franz擴散池上，并用生理鹽水水合。使用前，采用英國Biox AquaFlux經皮水分流失測量儀評估皮膚膜完整性。暴露1.77平方厘米的皮膚區域，分別將含1%cafe或0.1%睪酮的乳膏或液體制劑，按5、10、25、50毫克/平方厘米或5、10、25、50微升/平方厘米的用量涂抹于暴露區域。涂抹時，通過無菌注射器向供給室注入約8.85、17.7、44.25和88.5毫克（或微升）的制劑，以保證實驗條件適宜。僅將擴散池標準頂部組件固定在皮膚膜上，減少采樣過程中的反向擴散。

（Biox AquaFlux經皮水分流失測量儀）

隨后，用新鮮受體液沖洗自動進樣器后，采集200微升受體液樣品，采樣時間設定在涂抹后0、1、2、4、8、12和24小時。用BD™酒精棉片將殘留制劑沖洗三次，棉片收集于提取溶劑中（cafe用40毫升50%（體積分數）甲醇，睪酮用20毫升甲醇），全程為每個測試收集沖洗樣品（WASH）。用思高膠帶剝離皮膚表面15次，獲取角質層（SC）上的殘留制劑樣品。將使用過的皮膚膜用手術剪剪成8塊，置于適宜溶劑中提取（cafe用20毫升50%（體積分數）甲醇，睪酮用10毫升甲醇），得到皮膚樣品（SKIN）。總吸收率按皮膚樣品和受體液樣品中測得的睪酮總量，與涂抹的睪酮總用量的比值計算。

結論：

總之，為獲取用于暴露風險評估的保守皮膚吸收數據，建議乳膏制劑采用5或10毫克/平方厘米的劑量，液體制劑采用5或10微升/平方厘米的劑量。該劑量范圍與現有法規中的劑量要求相近或更為寬松。根據韓國化妝品人體表面積使用統計數據，該建議劑量范圍也處于韓國各類化妝品每表面積每日用量（0.005714–18.75毫克/平方厘米）及歐洲同類用量（0.01086–15.63毫克/平方厘米）之內，因此所選應用條件具有實際可行性。

本研究采用Franz擴散池進行皮膚吸收測試，該方法可作為動物替代測試方法應用于化妝品研究。所用微型豬（Micropig®）剩余皮膚作為實驗供體，相較于大鼠皮膚體外測試方法，在動物倫理方面更具優勢。

本研究結果有望適用于其他藥物，即其他藥物可能呈現相似趨勢。通常，皮膚吸收率以“滲透量"占“應用量"的百分比計算，且已知化學物質在無限劑量條件下的滲透量會趨于恒定。

因此，若對其他藥物采用足夠高的應用量（即無限劑量）進行皮膚吸收測試，其滲透量將保持恒定，僅應用量增加，皮膚吸收率預計會下降。Frasch等人也提出，化學物質的應用負荷對皮膚吸收率影響顯著。

本研究有望為化妝品、藥品及各類化學物質的監管提供參考。但本研究存在局限性：僅使用了兩種測試物質。若能采用具有不同辛醇-水分配系數（LogKow）值的測試物質進行多組結果對比，或將研究重復次數增加，將有助于減少數據離散度、提高數據一致性。

參考文獻：

【1】Im, J.-E., Kim, H.Y., Lee, J.D., et al. Effect of Application Amounts on In Vitro Dermal Absorption Test Using Caffeine and Testosterone. Pharmaceutics, 2021, 13(5), 641.

【2】OECD. Guidance Document for the Conduct of Skin Absorption Studies. 2004.

【3】Lehman, P.A., Raney, S.G., Franz, T.J. Percutaneous absorptionin man: In vitro-in vivo correlation. Skin Pharmacol. Physiol., 2011,24(5), 224-230.